据World Alzheimer Report 2015统计,如今全球有超过46 000 000人患有痴呆症（Dementia）,预计到2050年,这一数字会上升到131 500 000人,且用于治疗痴呆症的花费高达8180亿美元,带来了巨大的社会负担
[1]。痴呆症中最常见的类型是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）,患者渐进性地失去记忆和认知功能,病程可长达数十年,最终丧失生活自理能力,这严重影响了患者的预期寿命和生活质量。然而目前的治疗方案只能缓解症状,减缓病情发展,但是神经元的损害是不可逆的,因此寻找一种早期诊断AD的方法迫在眉睫。
轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）患者与同龄人相比记忆和认知功能缺损,但尚未达到AD的诊断标准
[2]。患有记忆缺损和MCI的人更容易受到侵害,并向AD进展。特别地,相比于健康老年人每年的AD转化率为1%~2%,MCI高达15%~20%
[3]。甚至,一些神经病理学研究认为：遗忘性MCI是健康老年人和AD之间的过渡状态
[4]。因此,早期诊断MCI以及识别MCI向AD的进展具有重要的临床价值
[5⇓-7]。有一些研究揭示了MCI患者的解剖和功能主要缺失在颞叶、边缘系统和额叶
[8⇓⇓⇓-12],代谢率降低与灰质体积减小有显著的相关性
[13]。因此,脑结构和功能联合研究正在成为现阶段痴呆影像学研究的热点。
Voxel based morphometry（VBM）是一种评估组间灰质、白质萎缩程度的自动分析技术,成功应用于运动障碍
[14]、癫痫
[15]、多发性硬化
[16]、精神分裂症
[17⇓-19]、痴呆
[11]、轻度认知障碍
[9]等疾病之中。静息态功能磁共振（resting state functional MRI, rs-fMRI）的研究方法很多,其中基于图论的功能连接密度（functional connectivity density, FCD）分析是一种数据驱动方法,不需要很明确的先验假设,可从数据本身出发直接衡量每个体素存在的显著功能连接数目,得到全脑体素的功能连接密度分布图,从更广范围探讨疾病的影响
[20-21],因此,本研究,将联合VBM和FCD研究MCI和AD患者的脑结构和功能改变,以期为痴呆的早期诊断奠定理论基础。
1 资料与方法
1.1 资料
本次研究共招募了73例研究对象,包括19例AD患者,22例MCI患者,以及32例健康老年人对照组（NC）。所有被试均来自南京大学医学院附属鼓楼医院,此研究经医院医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 仪器与数据采集
此研究采用3.0 T磁共振对所有受试者行全脑结构象与功能像数据采集（Achieva 3.0 T TX, Philips Medical Systems, Eindhoven, Netherlands）,采用8通道相控阵列线圈。被试在黑暗的环境中行仰卧位,保持头抬起高于水平面10~15度,研究员指令被试保持不动,闭眼但保持清醒,不特意进行思考。静息态功能磁共振采用回波平面成像（EPI）采集全脑信息,扫描参数：层厚4 mm（无层间隙）;矩阵64×64;视野,192 mm×192 mm; 2 000/30;翻转角,90°。每个功能磁共振图像序列包含230个脑体积,每个脑体积包含35层轴向剖面,扫描方位沿着胼胝体前-后联合线。每个被试都进行高分辨率T1W结构扫描,TR/TE/FA=7600 ms/3 400 ms/8°, FOV=256 mm×256 mm×178 mm,层厚=0.8 mm,中间无层间隙,采集时间=7 m 18 s。
1.2.2 VBM图像预处理
使用SPM8（Welcome Trust Center for Neuroimaging, London, UK,
http://www.filion.ucl.ac.uk/spm/software/spm8/）,用DARTEL基于体素水平进行形态学测量。程序包括5个步骤
[22]：（1）检查每个被试的扫描结果和总体的解剖学异常;（2）设置图像原点于前联合;（3）将图像分割为GM、WM、CSF; （4）按照John Ashburner包括Montreal Neurological Institute（MNI）空间转换的标准,使用DARTEL产生一个高维度标准化方案
[23]; （5）使用源于空间标准的Jacobian决定因素对被分割的图像进行调整
[24]。检查整个样本的同源性,以及使用全宽半高为8mm的Gaussian核进行标准平滑。
1.2.3 BOLD图像预处理及gFCD、sFCD、lFCD图的计算
1.2.3.1 BOLD图像预处理
使用DPARSF V2.2(
http://www.restfmri.net)软件对静息态fMRI进行时间校正、头动校正（数据剔除）。将BOLD数据配准到3DT
1W数据,对数据去线性漂移,并将个体头像配准到Montreal Neurological Institute（MNI）空间,在0.01~0.08 Hz频段内进行滤波。最后检查数据质量,头动校正,排除不符合要求的被试。
1.2.3.2 FCD的计算
基于Linux平台,使用Matlab程序脚本分别计算所有被试的短程功能连接密度（short-range FCD, sFCD）和长程功能连接密度（long-range FCD, lFCD）值,其基本原理是计算某两个体素的BOLD信号时间序列间的Pearson相关系数,首先将相关系数阈值定为0.6,大于该阈值视体素间存在功能连接,继而
计算任意给定体素存在功能连接的体素数
[20],再对与原体素有功能连接的体素计算相邻体素的功能连接,依次类推,直到计算到外周体素没有新的功能连接,定义所有被计算过的体素数为原体素的sFCD值。计算原体素的全脑功能连接密度（global FCD, gFCD）,其数值表示该体素与全脑体素的功能连接数,用gFCD减去sFCD值则定义为lFCD。然后将计算所得的lFCD和sFCD值进行Z转化,并对数据使用平滑为8的高斯平滑核进行空间平滑处理,进一步提高数据的正态分布性。
1.3 统计学方法
使用REST
[25]软件进行统计学分析,从VBM的结果中提取GM的文件,用方差分析计算AD、MCI、NC 3个组体素水平的组间差异,年龄、性别作为协变量,显著性标准设定为
P< 0.01（Alphasim校正,全脑灰质模板）。有显著差异的区域作为模板,再对3个组两两进行两样本
t检验,验证结果的显著性。
对BOLD数据结果Z转化且平滑处理后,使用方差分析对三个组lFCD、sFCD和gFCD进行比较,年龄、性别作为协变量。显著性标准设定为P< 0.01（Alphasim校正,全脑灰质模板）。有显著差异的区域作为模板,再对三个组两两进行两样本t检验,验证结果的显著性。
2 结果
2.1 研究对象基本信息
本实验被试共三组：19例AD, 22例MCI和32例NC。通过方差分析可以得出,三组在年龄、性别均无显著差异。AD、MCI的MMSE显著降低（P< 0.01）,而CDR显著升高（P< 0.01）。（如表1）
| 指标 | AD | MCI | NC | P值 |
|---|
| 年龄 | 73.37±11.74 | 71.86±10.08 | 68.64±11.62 | 0.307 |
| 性别 |
|
|
| 0.735 |
| 男 | 10 | 12 | 21 |
|
| 女 | 9 | 9 | 12 |
|
| MMSE | 16.74±4.58 | 24.62±1.72 | 28.82±1.29 | <0.001 |
| CDR | 1.68±0.82 | 0.48±0.11 | 0.00±0.00 | <0.001 |
2.2 VBM脑灰质体积比较
AD、MCI和NC脑灰质体积的方差分析显示,三组之间全脑灰质有多处改变,其中左侧、右侧海马及海马旁回、左侧中央前回差异显著（p value< 0.01）,结果通过Alphasim校正。右侧海马及海马旁回减少的体素总数为3642个,左侧海马及海马旁回减少的体素总数为6053个,左侧中央前回减少的体素总数为898个。
对各组被试的脑灰质体积做两样本t检验：AD与NC相比,左侧海马及海马旁回、右侧海马及海马旁回显著萎缩（p value< 0.01）,结果通过Alphasim校正,左侧海马及海马旁回减少的体素总数为6892,右侧海马及海马旁回减少的体素总数为3277; AD与MCI相比,左侧海马及海马旁回、右侧海马及海马旁回和右侧颞叶显著萎缩（p value< 0.01）,结果通过Alphasim校正,左侧海马及海马旁回减少的体素总数为3838个,右侧海马及海马旁回减少的体素总数为3278个,右侧颞叶减少的体素总数为2126个。MCI与NC脑灰质体积的比较,脑区未见显著差异。（如表2、图1）
表2 AD、MCI和NC脑灰质体积方差分析 显著改变的脑区信息 |
| 脑区 | Voxel Size | MNI Coordinates (mm) | Peak intensity |
|---|
| X | Y | Z |
|---|
| Hippocampus_R | 3642 | 19.5 | -3 | -16.5 | 16.2523 |
| Hippocampus_L | 6053 | -25.5 | -7.5 | -12 | 16.9787 |
| Precentral_L | 898 | -37.5 | -19.5 | 58.5 | 12.8856 |
通过提取各组被试三个显著差异脑区的灰质体积,对三组体积做两样本t检验可知：左侧海马及海马旁回AD与MCI、AD与NC相比显著减小（P< 0.01）,MCI与NC相比无显著差异（P=0.91）;右侧海马及海马旁回AD与MCI、AD与NC相比显著减小（P< 0.01）,MCI与NC相比无显著差异（P=0.20）;左侧中央前回AD与NC、MCI与NC相比显著减小（P< 0.01）,AD与MCI相比无显著差异（P=0.12）。（如图2）
图2 AD、MCI、NC脑区灰质体积柱状图注：柱状图中上限和下限为标准差。“**”表示P< 0.01,差异有统计学意义。 |
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2.3 gFCD, sFCD和lFCD的空间分布比较
通过对AD、MCI、NC三组的sFCD进行方差分析,可以发现楔前叶有显著变化（P< 0.01）,结果通过Alphasim校正,变化的体素总数为183个;AD与MCI、AD与NC相比,楔前叶的sFCD有减小的趋势（P< 0.01）,但结果未通过Alphasim校正;MCI与NC相比,楔前叶sFCD有增加的趋势（P< 0.01）,但结果未通过Alphasim校正。（如图3）
(A) AD、MCI、NC组间皮质厚度的差异检验图：ANCOVA是AD、MCI、NC三组的方差分析结果;AD vs. NC是AD组相比NC组皮质变化的程度;AD vs. MCI是AD组相比MCI组皮质变化的程度;MCI vs. NC是MCI组相比NC组皮质变化的程度;AD vs. NC、AD vs. MCI和MCI vs. NC中红色、黄色是增多,蓝色、青色是减少。图中有颜色的区域表示P< 0.01,有显著差异,各结果均通过Alphasim校正。(B) Brainnet全脑3D俯视图：图中显色区域为AD、MCI、NC三组的方差分析结果中显著差异的脑区,红色为右侧海马及海马旁回,黄色为左侧海马及海马旁回,左侧中央前回差异区域相对较小无法显示。
（A）AD、MCI、NC组间sFCD的差异检验图：ANCOVA是AD、MCI、NC三组的方差分析结果;AD vs. NC是AD组相比NC组sFCD变化的程度;AD vs. MCI是AD组相比MCI组sFCD变化的程度;MCI vs. NC是MCI组相比NC组sFCD变化的程度;AD vs. NC、AD vs. MCI和MCI vs. NC中红色、黄色是增多,蓝色、青色是减少。图中有颜色的区域表示P< 0.01,有显著差异,其中ANCOVA结果通过Alphasim校正,其他结果未通过。（B）AD、MCI、NC的sFCD方差分析具有显著变化的脑区对AD、MCI、NC三组的gFCD和lFCD进行方差分析和两样本t检验,未发现显著差异。通过提取各组被试楔前叶的sFCD的均值,对三组sFCD做两样本t检验可知,AD与MCI、AD与NC相比显著减小（P< 0.01）,MCI与NC相比有减小的趋势（p=0.06）;通过提取各组被试楔前叶的lFCD的均值,对三组lFCD做两样本t检验可知,AD与MCI（P=0.07）、AD与NC（P=0.02）相比有减小的趋势,MCI与NC相比无显著差异（P=0.75）;通过提取各组被试楔前叶的gFCD的均值,对三组gFCD做两样本t检验可知,AD与MCI（P=0.07）、AD与NC（P=0.02）相比有减小的趋势,MCI与NC相比无显著差异（P=0.70）（如图4）。
图4 AD、MCI、NC的楔前叶sFCD、lFCD、gFCD柱状图注：柱状图中上限和下限为标准差。“**”表示P< 0.01,差异有统计学意义。 |
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3 讨论
AD是一种在老年人中最常见的神经退行性疾病,脑内的病理改变为淀粉样沉积物和神经纤维缠结,这导致了进展性的神经元损害和随之而来的脑萎缩
[26]。MCI被认为是认知障碍发展到AD的中间阶段,主要表现为认知功能减退,也可影响其他功能,根据是否有记忆力损害可分为遗忘型MCI和非遗忘型MCI,根据受累范围可分为单纯记忆损害型和多认知域损害型
[27]。
VBM方法是经典的基于影像学研究脑萎缩的方法。本课题组采用VBM方法发现AD两侧海马及海马旁回有显著萎缩,与其他研究报道一致
[28⇓⇓-31]。海马和海马旁回共同构成内侧颞叶,是组成大脑边缘系统的重要部分,负责记忆及空间定位,海马所影响的记忆主要是情景记忆（自传体记忆）,以及语义记忆,而对程序性记忆几乎没有影响。已有大量研究证实,海马和海马旁回萎缩为AD的早期表现
[31]。Guo等
[28]应用VBM的方法发现AD患者两侧的海马、海马旁回、颞上叶、颞中叶和右侧楔前叶的灰质显著萎缩,且灰质体积的变化与临床症状显著相关,在海马和海马旁回的灰质萎缩可以明确的区分AD和MCI,这提示灰质体积的变化对于MCI的早期诊断是有帮助的,其他一些研究对此观点进行了证实和补充
[29-30]。本研究发现,AD和MCI均出现左侧中央前回显著萎缩,中央前回位于中央沟前面,负责将长轴突发送到对侧运动核和脊髓腹角的下运动神经元,这些轴突形成皮质脊髓束,支配躯体的运动,此研究结论尚未见其他文献报道,还需要加大样本量证实,并进一步探讨其发生和发展的机制。
研究发现,AD患者脑功能改变早于结构改变,目前最常用的rs-fMRI 的研究方法是功能连接（functional connectivity, FC）分析。研究人员发现AD和MCI的默认网络（default-mode network, DMN）在静息状态下早期FC增强,随着疾病进展,FC逐渐减弱,因此DMN在静息状态下的激活程度改变可以作为区分AD、MCI和NC的重要指标
[32-33]。DMN即脑在静息状态下激活的区域,由内前额叶皮层的背侧和腹侧、楔前叶/后扣带皮层、侧顶叶、颞叶皮层和内侧颞叶共同组成
[34],其相关脑区构成的一组高度有序的功能网络,它在不同任务激活时呈现一定程度的衰减,研究发现,该网络可能与人脑的意识、陈述性记忆有关
[21]。此外Han等
[35]发现MCI患者左侧中央前回FC增强,这一功能与结构变化的相关性有待进一步研究。
但是FC分析的缺点在于它仅能笼统地得到体素与全脑的连接情况,不能进一步区分体素与局部和远处的连接情况,具有一定的局限性,因此有学者提出了gFCD、sFCD和lFCD的研究方法
[20],相比于FC能更加直观地表示异常脑区与短程和长程的功能连接关系,从而探讨疾病发生发展的机制。FCD是一种基于体素数据驱动的快速计算方法,可以从密度角度反映节点在信息处理中的作用,gFCD是计算体素与全脑功能连接的数量,sFCD是体素与局部区域的连接数量,lFCD是gFCD与sFCD之差,反映了体素与远处其他区域的连接数量。在AD和MCI的研究领域,尚未见关于FCD的报道。本研究发现,AD与MCI和NC相比楔前叶sFCD显著降低,而MCI与NC相比楔前叶sFCD部分区域增加,这可能是因为早期楔前叶sFCD代偿性增加,与周围脑区连接更加紧密,随着疾病的进展最终逐渐降低,这与上述DMN的FC变化趋势相一致,这一发现可能有助于AD和MCI的早期诊断。楔前叶是DMN的重要组成部分,研究表明,楔前叶/后扣带皮层负责从自身和外周收集和分配信息,楔前叶还与短时间记忆回想
[36]以及对环境的定位
[37]有关。有轻度遗忘倾向的患者静息态默认网络功能连接和楔前叶/后扣带皮层区域同质性衰减,这些患者未来可能面临AD的风险
[38]。早期研究发现,AD与NC相比,楔前叶与内侧颞叶等区域的静息态活动减少
[39],此外,楔前叶在事件回忆中起重要作用,这与楔前叶是AD最早代谢减弱脑区的结论相一致
[40]。本研究发现,AD、MCI、NC的gFCD和lFCD没有显著改变,因此我们可以做出基于统计的预测,AD、MCI患者脑功能连接密度在楔前叶发生改变,且最先影响临近的脑区,这也符合解剖学的规律,通过比较AD、MCI、NC楔前叶的lFCD和gFCD可知,AD患者的lFCD和gFCD也有下降的趋势,说明楔前叶与远处脑区及全脑的连接也在减弱,但幅度明显小于sFCD。
本研究尚存在一些局限性,研究中缺乏对脑结构和功能退化的相关性研究,未分析sFCD的减少与灰质体积的降低是否存在相关关系。在接下来的研究中,本课题组将会基于246个功能脑区
[41]进行结构和功能的关联分析,探讨脑结构和功能退化的生理病理学机制。
综上,本研究证实了AD和MCI患者脑灰质萎缩的区域。首次探究了AD、MCI和NC脑FCD的差异,为AD和MCI患者脑结构和功能退化的机制研究奠定了理论和方法学基础,有助于临床的早期诊断和治疗。
