1 前言
阿尔茨海默病 (Alzheimer's Disease, AD) 是一种常见的神经系统退行性疾病,是痴呆中最常见的类型。轻度认知功能损害 (Mild Cognitive Impairment, MCI),特别是遗忘型MCI(amnestic MCI, aMCI)是介于正常衰老和痴呆之间的一种过渡状态,指有轻微的记忆或认知损伤,尚未达到痴呆诊断标准,具有较高AD转化风险的前驱期。Braak根据尸检研究对AD进行病理分期提出AD病理改变最早出现于内侧颞叶的海马与内嗅皮层,逐渐向周围扩散
[1],还有学者研究发现在AD早期嗅球、嗅束与嗅神经即受累
[2,3],嗅觉功能在认知障碍出现的数年前即发生变化。尽管嗅觉功能的改变对AD的研究非常重要,但是目前嗅觉相关研究较少。静息状态功能磁共振（rs-fMRI）易于认知障碍患者配合,是研究AD大脑功能变化的有效手段。本研究结合嗅觉行为学测试及初级嗅觉皮层的功能连接等方面详细探讨AD嗅觉变化特点。
2 资料与方法
2.1 资料
本研究受试者均来源于2015年1月至2016年2月天津市环湖医院痴呆诊疗中心门诊就诊的患者,经本人或法律监护人同意参与并签署知情同意书,所有程序均遵循天津市人体试验委员会所指定的伦理学标准进行并经过天津市环湖医院伦理委员会批准。实验开始前所有受试者接受免费体格检查、心理检查、实验室检查,实验中所有受试者均未服用任何影响认知功能药物。受试者均为右利手,并接受一系列神经心理学筛选量表检查,同时进行颅脑磁共振扫描。
所有受试者均符合美国老龄协会和阿尔茨海默病工作组（the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups）关于阿尔茨海默病诊断指南的临床核心标准
[4⇓-6]。因嗅觉测试需要受试者配合,为保证嗅觉测试的准确性,本研究因此选取轻中度痴呆患者,AD入组标准：
（1）符合美国国家神经病及语言障碍和卒中研究所（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke, NINCDS）-阿尔茨海默病及相关疾病学会（Alzheimer's Disease and Related Disorders Association, ADRDA）制定的很可能AD痴呆诊断标准;
（2）临床痴呆评定量表评分为1或2分;
（3）未使用影响认知能力的药物,如乙酰胆碱酯酶抑制药、NMDA受体拮抗剂或其他益智药物;
（4）可以配合完成神经心理测试和颅脑MR扫描;
（5）可以配合完成嗅觉测试。
（1）有认知功能减退主诉或有知情人提供的临床显著认知功能减退症状,且症状至少持续6个月;
（2）临床痴呆评定量表评分为0.5分;
（3）日常生活活动能力正常,ADL评分< 26分;
（4）认知功能减退尚未达到痴呆诊断标准。
（1）年龄> 65岁,总体认知功能正常;
（2）临床痴呆评定量表为0分;
（3）无记忆力及其他认知功能减退主诉;
（4）日常生活活动能力正常。
（1）脑外伤病史或脑部其他疾病病史;
（2）精神类疾病病史,如精神分裂症,或抑郁症等;
（3）帕金森综合征,癫痫或其他能影响认知功能的神经系统疾病;
（4）颅脑MR显示局灶性脑改变：关键部位的梗死,如角回、海马、扣带回,有多个（2个或2个以上）梗死灶或白质疏松病变（Hachinski缺血指数≥7分）;
（5）维生素B12或叶酸缺乏、甲状腺功能减退;
（6）可引起脑功能障碍的神经系统疾病和严重内科疾病,如：肺性脑病,肝性脑病,肾性脑病,高血压不稳定期,急性心肌梗死,不稳定心绞痛,活动性消化性溃疡,严重贫血,甲状腺功能低下,严重糖尿病,严重营养不良等;
（7）体内存在金属异物的患者,如假牙,心脏支架,或其他不能完成颅脑MR检查的情况。
（8）生物学标志物提示其他神经系统（非AD）退行性病变者。
通过上述诊断和排除标准,最终根据至少2名神经内科专家确认,本研究共纳入100例受试者,其中AD患者40例,MCI患者35例,健康志愿者25例,为了研究人群的一致性及延续性,本研究纳入的MCI患者均为典型的aMCI患者。
2.2 方法
1. 神经心理量表测评：由经过正规培训、操作熟练的神经科医师对其进行各项神经精神量表评价,包括：简易精神状态检查量表(MMSE)
[8]、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)
[9,10],神经精神量表(NPI)
[11]、日常生活活动能力量表（ADL）
[12]、临床痴呆评定量表（CDR）等。
2. 嗅觉检测：（1）T&T嗅觉计定量检查法：应用T&T嗅觉计定量检测嗅觉
[13]。在通风良好、无背景气味的环境中,用15 cm×0.7 cm的无味滤纸前端蘸1 cm的嗅素液,置于受检者前鼻孔下方1~2 cm处,嗅闻2~3次,依次由低浓度到高浓度顺序检测。首先测试察觉阈,之后测试识别阈。共计算5种嗅素的平均阈值,所测得的结果做出嗅觉图,根据其识别阈值将嗅觉功能分为6级：均值小于-1为嗅觉亢进,-1~1为嗅觉正常,1.1~2.5为嗅觉轻微下降,2.6~4.0为嗅觉中度减退,4.1~5.5为嗅觉严重减退,5.6以上为嗅觉丧失。嗅觉测试前选取不相关气味进行测试,保证受试者正确理解及顺利完成测试。
2.2.1 磁共振数据采集及处理
所有受试者均在天津市环湖医院放射科接受磁共振检查,设备为skyra 3.0T磁共振系统,应用8通道头颅线圈。为了尽量减弱机器噪声对受试者的影响及减少患者头动,扫描前给予受试者佩戴耳塞,并给予固定带及泡沫垫固定头部,扫描过程中要求受试者仰卧、闭眼、避免任何系统性的思考,尽量放松保持身体静止不动。静息态血氧水平依赖效应（blood oxygen level dependent, BOLD）信号采集应用梯度回波结合单次激发回波平面成像（echo planar imaging, EPI）序列,具体参数如下：重复时间=2000 ms,回波时间=30 ms,视野=220 mm×220 mm,翻转角FA=90°,矩阵=64×64,层厚=3 mm,层间距=1 mm,轴位扫描36层,每个被试者扫描200个全脑,共6000张图像,持续时间为6分40秒。
功能磁共振数据的预处理使用国际通用的Statistical Parametric Mapping（SPM 8,
http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/sp）及基于SPM的in-house Brainnetome fMRI toolkit（Brat,
www.brainnetome.org/brat）软件进行数据预处理,由中国科学院自动化研究所协助完成。剔除前10幅图像以达到磁场稳态及被试适应环境,对剩余的230幅图像按常规方法进行预处理,包括层间时间校正、头动校正、空间标准化、去噪、滤波（0.01~0.08 Hz）、空间平滑等。
研究证实,头动对功能相关分析十分重要,很小的头动即可对静息态功能数据产生显著影响,特别是对网络分析及功能连接结果的准确性十分敏感,因此,本课题组进一步计算了每个受试者的头动情况。本研究中任何受试者在x、y、z三个方向上的头动位移超过3 mm（1个体素）大小或在x、y、z三个方向上的旋转超过3°将被剔除,最终符合条件的受试者共100例。然后,本课题组根据Van Dijk等
[14]提出的标准评估了三组之间头动情况,单因素方差分析结果显示AD、aMCI、NC三组间头动参数差异无统计学意义（
P> 0.05）。
结合既往研究选取初级嗅觉皮层（POC）感兴趣区
[15],并利用解剖标定模板和WFU_PickAtlas (www.ansir.wfubmc.edu)工具来划分（见图1）。
2.2.2 POC功能连接分析
本研究将左侧初级嗅觉皮层ROI内所有体素的时间序列进行平均,将此序列作为参考序列,然后用该参考序列和全脑每个体素的时间序列做Pearson相关,从而获得相关图,相关图内的每一体素的取值代表左侧初级嗅觉皮层与它的相关强度。由于相关系数不服从正态分布,因此我们应用Fisher r-to-z转换将相关系数转化为Z值以改善其正态性,得到每名被试的功能连接Z值图,转化公式如下：
考虑到年龄和性别对功能连接的影响,本课题组将年龄和性别作为协变量对Z值进行线性回归,然后分别统计组内的功能连接图和组间功能连接差异图。组内分析应用SPM8软件对每名被试大脑的每个体素的
Z值进行独立样本、双侧
t检验,从而得到与左侧POC有明显功能连接的脑区（
P< 0.01,未校正）。之后在AD和NC两组进行双样本、双侧
t检验以确定两者间存在差异的脑区。本课题组将团块体素阈值为60,从而得到经蒙特卡洛模拟法校正后的阈值为Palpha< 0.001(
http://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/manual/AlphaSim.pdf)。最后将统计图叠加到AAL模板进行显示。右侧POC的统计处理过程同上。
随后,本课题组将通过上述方法确定的存在差异的脑区作为感兴趣区进行各组之间的两两比较,并将MCI患者的功能连接平均强度纳入分析,以评估功能连接强度在疾病不同阶段的变化情况。各组之间的统计学比较采用双样本、双侧t检验（P< 0.05, FDR校正）。
3 结果
3.1 人口学资料
由表1可见,三组被试的年龄、性别之间差异无统计学意义(P> 0.05),AD、MCI组较NC组受教育年限少（P< 0.05）,而AD、MCI组间差异无统计学意义;而三组被试的MMSE、MoCA成绩之间差异有统计学意义(P< 0.001),两两Post hoc分析发现AD与MCI、AD与NC、MCI与NC组比较时差异均有统计学意义;三组被试的ADL总分间差异有统计学意义（P< 0.001）,AD组较NC和MCI得分更高,日常生活能力受损更重。
| 指标 | NC (n=25) | MCI (n=35) | AD (n=40) | P value |
|---|
| 性别(男/女) | 10/15 | 11/24 | 21/19 | 0.755 |
| 年龄(岁) | 65.48±6.03 | 65.51±8.42 | 67.30±8.31 | 0.534 |
| 教育程度（年） | 12.68±2.78 | 10.57±4.28a | 10.10±3.89a | 0.027 |
| MMSE（分） | 28.80±1.16 | 25.46±3.16a | 15.85±5.64a,b | <0.001 |
| MoCA（分） | 27.00±1.16 | 20.74±3.67a | 11.07±5.17a,b | <0.001 |
| ADL（分） | 20.00±0.00 | 20.80±1.51 | 29.97±7.67a,b | <0.001 |
| 察觉阈值（分） | -1.95±0.09 | -1.64±0.88 | -1.59±0.52 | 0.086 |
| 识别阈值（分） | 0.12±2.05 | 1.39±2.55a | 4.14±2.13a,b | <0.001 |
| 头动 | 0.19±0.117 | 0.20±0.10 | 0.24±0.17 | 0.185 |
| 三组间性别差异采用卡方检验进行比较,年龄、教育程度、MMSE、MoCA、ADL及头动得分采用单因素方差分析和post hoc多重比较检验。a与NC组比较P< 0.05; b与MCI组比较P< 0.05。 |
3.2 嗅觉测评情况
应用T&T嗅觉计定量检查法测评,发现NC、MCI、AD三组的察觉阈值逐渐增高,但差异未达到统计学意义（NC：-1.95±0.09, MCI：-1.64±0.88,AD：-1.59±0.52; F=2.53,P=0.086）;三组的识别阈值间则存在显著差异(P< 0.001),与NC组比较,随疾病严重程度加重,识别阈值逐渐增高,AD组最高,MCI组介于AD和NC组之间,两两组间差异均有统计学意义（详见表1）。
3.3 初级嗅觉皮层功能连接
分别以左右侧POC与全脑进行功能连接分析,发现双侧POC与全脑各个脑区间的功能连接在三组间差异无统计学意义（P> 0.001）,见图2,且功能连接强度与嗅觉行为学成绩无明显相关性。
3.4 嗅觉功能与认知的相关性
将MCI及AD合为一组进行相关分析研究。分析嗅觉测评成绩,特别是识别阈值与其他参数的相关性,发现识别阈值与年龄（r=0.110,P=0.38）、受教育程度（r=-0.034,P=0.78）无明显相关性,而识别阈值与MMSE及MoCA成绩则存在显著负相关,认知功能越差,嗅觉阈值越高,嗅觉受损越严重,即嗅觉受损程度与疾病严重程度相关（见图3）。最后,分析嗅觉行为学数据与POC功能连接的相关性,二者无显著相关性。
图3 嗅觉测评成绩与年龄、教育程度及认知功能的相关性 |
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4 讨论
本研究通过对嗅觉测评及初级嗅觉皮层功能连接的研究发现,从行为学角度看,AD及MCI患者嗅觉功能受损,表现为察觉阈值与正常人相比无明显损害,而嗅觉识别域值则明显高于正常人,即表现出分离的嗅觉识别缺陷,且与疾病严重程度相关;而功能连接方面,三组间初级嗅觉皮层与全脑功能连接未见明显异常,与疾病严重程度无关。
嗅觉障碍主要表现为：嗅觉阈值与嗅觉识别。嗅觉阈值即人体所能感知到的最低嗅素浓度,反映嗅觉感知力,嗅觉识别是对各种嗅素的识别能力。本研究发现较正常人,MCI、AD患者表现为明显嗅觉识别障碍,既往大量研究也发现AD患者的嗅觉识别能力低于正常同龄老年人
[16],这种减退可能在出现AD症状的数年前
[17-18],也有学者发现AD患者嗅觉识别功能减退与认知功能存在相关性,嗅觉识别功能检查可作为评价疾病进展的方法
[19]。值得注意的是,相比识别阈值,本研究中AD、MCI患者察觉阈值与正常人相比无明显损害,嗅觉阈值主要反映周围嗅觉结构的功能,而识别阈值则主要反映中枢性嗅觉功能,这种分离的嗅觉识别缺陷说明其嗅觉功能减退与嗅觉中枢相关,也与认知功能相关,同既往研究结果一致
[20]。嗅觉中枢主要包括前嗅核、梨状皮层、内嗅皮层、杏仁核等。通过对初级嗅觉皮层的形态学研究发现AD或MCI患者上述嗅觉结构较正常人萎缩
[21-22],且存在显著的组织病理学改变,如神经元纤维缠结、老年斑形成。Braak根据尸检研究对AD进行病理分期提出AD病理改变最早出现于内侧颞叶的海马与内嗅皮层,逐渐向周围扩散
[1],还有学者研究发现AD早期嗅球、嗅束与嗅神经即受累,受累的程度与认知皮层受损程度有明显的相关性,并随Braak等级的提高而增高
[2-3]。另一项110例AD尸检结果显示,嗅觉系统受累达84%
[2]。因此,我们提示AD患者存在明显嗅觉障碍,其严重程度与认知功能相关,嗅觉功能检查有助于疾病的早期诊断。
嗅觉行为测试仍存在一些局限性,它需要受试者良好配合,重度痴呆患者因配合差、严重认知损伤可造成假阳性结果,虽然本实验选取轻中度AD患者尽量避免误差,同时也思考不需受试者配合、更加客观的嗅觉检测方法—静息态功能磁共振。目前有关嗅觉功能成像特点的研究不多,既往应用嗅觉任务成像技术发现,较正常受试者,AD和/或MCI患者POC区激活体积降低
[22],AD患者POC区BOLD信号强度减弱,但随嗅素浓度增高,BOLD信号增强,而在正常组则无此变化
[23],提示嗅觉任务功能成像技术有助于AD的早期诊断。但是,AD患者存在明显认知功能障碍,配合较差,部分受试者不能完成实验,因此本研究应用静息态功能磁共振技术探讨初级嗅觉皮层功能情况,本课题组发现在AD和MCI中其与部分脑区功能连接出现了改变的趋势,但差异无统计学意义。产生上述结果的原因是：一方面,功能磁共振成像以通过检验血流进入脑神经元的磁场变化来反映神经元代谢活动水平,不能得到神经元病理改变的直接证据,人脑功能机制较为复杂。其次,推测较认知脑区而言,嗅觉脑区可能与其他脑区间功能连接程度弱,导致差异不显著;另一方面可能原因是嗅觉脑区的代偿功能。嗅觉fMRI较其他感觉如视觉、听觉等功能磁共振成像更为复杂,虽然具体机制尚不明确,但仍提示嗅觉功能连接对研究AD病理生理机制提供了新的思路。
综上所述,AD及MCI患者存在明显嗅觉识别功能障碍,而嗅觉察觉功能相对正常,表现出分离的嗅觉识别缺陷,且这种缺陷与疾病严重程度相关;而功能连接方面,三组间初级嗅觉皮层与全脑功能连接未见明显异常。
