2022年第二期
脑脊液生物标志物检测在阿尔茨海默病诊断中值得注意的若干问题
日期：2023-11-22
生物标志物检测在阿尔茨海默病诊断中至关重要,其中脑脊液生物标志物检测因其高度的敏感性、特异性和可操作性,在临床上较示踪剂正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography,PET）更易普及。但目前国内医院脑脊液生物标志物检测大多依赖于院外的检测机构,且无统一的检测规范和标准,常导致检测结果误差较大。本文就脑脊液生物标志物检测过程中值得注意的若干问题作一概述,以期最大限度的缩小脑脊液生物标志物在临床检测中的误差,充分发挥其在AD早期诊断中的重要价值。
Abstract
Detection of biomarkers is crucial in the diagnosis of Alzheimer's disease, in which the examination of cerebrospinal fluid biomarkers is easier to be carried out than the tracer PET in clinical practice because of its high sensitivity, specificity and operability. However, at present, the domestic cerebrospinal fluid biomarkers testing is mostly affected by out-of-hospital testing institutions, and there is no unified detection criterion and standard,, resulting in large testing errors. Therefore, this article summarizes several noteworthy issues in the collection and detection of cerebrospinal fluid in order to minimize the error in the clinical detection of cerebrospinal fluid biomarkers and give full play to the important value of cerebrospinal fluid biomarkers examination in the early diagnosis of AD.
关键词
Key words
Alzheimer's disease / Biomarker / Cerebrospinal fluid examination
引用本文
安小娟 , 孟丹 , 蔡攀. 脑脊液生物标志物检测在阿尔茨海默病诊断中值得注意的若干问题. 阿尔茨海默病及相关病杂志. 2022, 5(2): 166-169 https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2022.02.014
AN Xiaojuan , MENG Dan , CAI Pan. Cerebrospinal fluid examination in the diagnosis of Alzheimer's disease on several issues worthy of attention. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders. 2022, 5(2): 166-169 https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2022.02.014
阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease,AD）是痴呆最常见的一种类型。1984年公布的美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所-老年性痴呆及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准是国际上最早公认的AD诊断标准。为了弥补NINCDS-ADRDA诊断标准的不足,2007年发布的国际工作组织(IWG)诊断标准中[1-2],AD的临床诊断由排除性诊断变为生物标志物诊断。在2011年发布的美国国立老龄研究所与阿尔茨海默病协会(National Institute of Aging and Alzheimer's Association,NIA-AA)标准及2014年IWG-2标准中[3⇓-5],强调将AD生物标志物分为诊断标志物和进展标志物,因此诊断标志物的检测在AD的诊断中至关重要。
目前,AD的诊断标志物检测主要包括脑脊液生物标志物检测和AD- PET显影。但由于AD-PET显影技术在国内仅有中国人民解放军总医院、天津环湖医院、复旦大学附属华山医院等少数医院中应用,绝大部分医院只能开展脑脊液中生物标志物检测。脑脊液中β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)水平的降低和磷酸化tau蛋白（p-tau）水平的增加是反映AD早期病理改变的主要诊断标志物,因此,脑脊液生物标志物在AD的诊断中具有重要意义。但由于目前国内临床脑脊液生物标志物检测主要依赖于院外检测机构进行检测,且脑脊液的采集和检测目前尚无统一的规范和标准,常导致检测结果误差较大,本文就脑脊液生物标志物检测中需要注意的若干问题作一概述。
1 脑脊液采集标准化共识
有研究显示,在脑脊液收集、储存和交换中的误差（分析前因素）可占实验室总误差的43%[6]。目前,国内大部分医院日常临床工作中仅按照脑脊液常规检查方法进行采取,并未按照标准化流程操作。因此,为了实现脑脊液生物标志物在临床实践中的准确应用和确保在检测脑脊液生物标志物时不受采集过程中的差异导致的影响,脑脊液采集方案的标准化显得至关重要。2009年,Teunissen等发表了1篇关于神经变性疾病脑脊液采集和生物库标准化的文章[7],其详细阐述了中枢神经系统变性疾病脑脊液采集的标准化操作流程,这是国际上作为脑脊液采集的公认的标准化操作方案。此后,2021年阿尔茨海默病协会进一步制定了相关标准化指南[8]。为统一脑脊液的收集、处理及储存过程和相关条件达成共识,为不同实验室间生物标志物检测的最终结果提供了可靠的依据。该流程有如下注意问题。
1.1 脑脊液采集的标准体积 由于脑脊液体积会影响生物标志物的成分,小体积（2 mL）脑脊液主要为腰硬膜囊成分,而大体积的脑脊液才是喙部或侧脑室成分。因此,腰椎穿刺采集脑脊液的标准体积应 ≥12 mL,最初的2 mL可用于常规的脑脊液分析,其余样本应在等分前混匀。
1.2 去除带血的脑脊液样本 由于血清浓度较高的生物标志物,如凝血因子、血液污染可能导致假阳性结果。因此,当红细胞计数>500/μL时不应用于生物标志物的研究。
1.4 收集与脑脊液样本相匹配的血清、血浆和DNA 由于血液中标志物的浓度通常会影响脑脊液中的浓度,因此采集匹配的血清和/或血浆对于评估脑脊液生物标记物具有重要意义;同时DNA的收集扩大了研究个体表型和基因型的可能性。
1.5 不同的离心条件及样品保存 采样后应尽快离心,如保存细胞,则于室温下400 g离心10 min;如不保存细胞,则于室温下2 000 g离心10 min;离心后,上清液样品应立即等分并存冻于-80 ℃冰箱中。
1.6 等分试样和储存 等分试样和储存均应采用无任何添加剂的小聚丙烯管,同时应进行及时密封,避免污染。
1.7 样品的冷冻/解冻 冷冻/解冻周期会影响生物标志物的浓度[9,11],故应避免重复冷冻/解冻样本;同时,Aβ42的浓度易受冷冻/解冻次数的影响[12-13],因此为了防止蛋白质降解,样本冻融循环最好不要超过3次。
1.8 等分体积 多份等分体积样本是避免其多次冷冻/解冻及避免其浪费的最佳方法,因此建议所用的聚丙烯试管径分别为0.25、0.5和1 mL,且每份试管填充体积应>75%[9],以防止样本在试管内冻干（因有研究发现[14]将试管填充体积从75% 降低到50%,会导致Aβ42浓度降低3.7%,这样可能会对最终的检测结果产生较大的影响）。
2 脑脊液检测方法的选择
如何以标准化方法检测AD患者脑脊液中的生物标志物水平是目前面临的一项重大挑战。一项生物标志物的全球多中心比较的试验室研究结果显示,生物标志物的浓度在不同实验室间有很大差异,而试验程序的标准化可显著减少实验室间的差异。Innotest酶联免疫吸附试验（ELISA）一直是常规脑脊液生物标志物分析中最常用的试验,但美国阿尔茨海默病协会国家质量控制计划的报告中明确指出[16],这一分析试验所导致的实验室间差异可超过15%[6]。近年来,为了减少人工免疫分析差异,已经开发了多重检测和(半自动)平台[17⇓-19],平台自动化的检测技术显著提高了实验室结果分析的可靠性。有研究将Innotest ELISAs获得的结果与全自动平台Elecsys检测、Lumipulse G检测脑脊液生物标志物结果进行比较[6,20],发现Innotest ELISAs与自动平台检测之间有很强的相关性,全自动Elecsys分析试验的实验室内和实验室间的差异为2%~5%,97%的Aβ42样本在Innotest和Elecsys之间的生物标记结果是一致的[21]。Lumipulse G和Innotest之间的总体一致率也非常高(>87.5%),表明全自动平台检测具有很高的分析性能,自动化平台检测可减少实验室内和实验室间的差异,并减少了周转时间,将这些检测方法引入AD的常规诊断,将减少样本和实验室之间的差异,获得更具有可重复性的生物标志物检测结果。
3 脑脊液中标志物的选择和指标临界值
在AD患者中,α-突触核蛋白、TDP43基因突变及血管病变等病理学变化可使任何单独的生物标志物都不具有100%诊断准确率的可能性[22]。虽然有研究显示,脑脊液中Aβ42的敏感度及特异度达到了85%~90%[13⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓-26],但至今未有研究报告指出脑脊液Aβ42水平能够毫无怀疑的直接用于AD的诊断;此外,尽管Aβ42/Aβ40比值是区分AD-MCI和额颞叶变性的最佳生物标志物[27],但仍未达到100%的敏感度和特异性,在额颞叶变性、血管性痴呆和路易体痴呆的患者脑脊液中均可检测到低水平的Aβ42。因此,当单独采用Aβ42诊断AD时,容易导致假阳性的发生。tau已被确认是AD的关键驱动因素,P-tau的灵敏度和特异性为96.3%、95%,但tau水平在AD患者和非AD老年人中有一定的重叠,睡眠不足可引起脑脊液和血液中tau水平的上升[28-29],且在脑炎及急性脑损伤导致的中风患者中脑脊液的P-tau水平也有所增高[30]。因此,诊断AD应综合选择Aβ42、P-tau和Aβ42/Aβ40比值,以减少误诊率。
虽然NIA-AA和IWG已将脑脊液生物标志物Aβ42纳入AD的临床诊断标准[31],但由于分析平台、实验室、各项操作间的不同,其最终临界值仍存在较大的可变性和差异性。奈特阿尔茨海默病研究中心队列中Aβ42临界值为1 098 pg/mL[32],而阿尔茨海默病神经影像学计划(Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative ADNI)队列中Aβ42临界值为977pg/mL[6,33]。目前,大多数研究只针对Aβ,关于P-tau临界值研究相对较少,且在已发表的tau临界值研究中差异均较大,其范围为61.82~120pg/mL[33]。
由于在各项研究报告中脑脊液生物标志物临界值所示结果差异较大,未能达成统一数值,且目前国际上也仍未给出确定的AD脑脊液生物标志物的临界值。因此,有必要制定一个统一的脑脊液生物标志物临界值,以便在临床诊断中应用。
4 AD-PET诊断AD的价值和局限性
有研究显示,当将脑脊液与PET同时结合起来用于诊断早期AD时,其敏感性和特异性均增加,具有很高的诊断效能[34]。在IWG-2诊断标准中,其中确诊条件之一为Aβ-PET的特征性显像。PET显像的诊断价值在于无创、敏感与鉴别能力强。有研究报告指出PET诊断AD的敏感度和特异性均可达到90%以上,如PET扫描Aβ结果为阴性,则可基本排除AD的病理诊断[35-36]。PET在AD诊断和病情评估等方面发挥着重要作用,但脑脊液生物标志物对弥漫性淀粉样蛋白的沉积则更为敏感[37-38]。在AD早期,异常的Aβ42/Aβ40比值可能是淀粉样脑病变的最早指标[39],其能够鉴别认知功能尚处于正常状态但已有早期病理改变证据的个体,可为AD的早期干预提供最佳的机会。
在AD诊断的敏感性与特异度方面,脑脊液生物标志物及PET大约相持在同一水平,但脑脊液分析更具有临床实践价值,其优势：①脑脊液分析成本较PET扫描低10~15倍,且不存在辐射暴露问题;②不需要患者前往配备有PET设备的医疗中心;③能够在一个样本量中同时分析多种生物标志物,提供更多与AD相关的病理信息。目前我国大多数医院还不可能将PET作为常规检查项目,这也使PET的使用受到了一定的限制。
5 结语
综上所述,脑脊液生物标志物在AD的早期诊断、预测其发展有着十分重要的价值,但由于目前脑脊液的采集尚未有统一的标准化操作流程,各个实验室之间的检测结果存在差异。因此,注意上述所述问题,尽可能做到脑脊液采集的标准化,使其最后的检测结果具有较好的可靠性与参考性,从而更好地用于AD的诊断和预测其发展。
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