阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经变性疾病，临床症状主要表现出认知和行为功能障碍。但目前AD致病原因仍不明确，许多研究认为β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）、过度磷酸化tau蛋白（p-Tau）、炎症因子浸润以及氧化应激因子刺激与AD发病进程息息相关
[1]。部分报道指出，色氨酸及其代谢物在体内不同的生理过程中起着关键作用，涉及从细胞分化增殖到调节机体对不同环境和饮食的应对。更有研究指出，色氨酸的代谢途径及其代谢物对神经退行性疾病具有预防和治疗作用，是维护大脑健康的关键物质
[2-3]。部分研究者对人脑内源性小分子进行全面筛选，结果表明色氨酸代谢产生的相关物质是先天免疫的生化调节因子，因此该物质被认为是潜在的内源性抗AD分子
[1]。近年来相关文献报道，高色氨酸饮食可减少小鼠海马区Aβ的沉积，该药效学作用机制尚不明确，但作者认为血清素（serotonin）发挥了主要作用
[4]。随着对色氨酸相关物质的深入研究，其色氨酸代谢物犬尿酸（kynurenic acid，KA）、5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindole-acetic acid，5-HIAA）可通过调节脑啡肽酶基因的表达和活性，从而增加神经元细胞存活和改善AD病理症状
[5-6]。不仅如此，另一代谢物褪黑素也能够改善AD的病理和恢复认知
[7]，阻止神经炎症，减轻抑郁症病理症状
[8]。因此，探究色氨酸及其代谢物在AD病理机制中作用，有利于寻找到基于这类物质防治AD的方法和途径。
本研究利用网络药理学全面地探究色氨酸及其代谢物防治AD的关键靶点及通路，预测可能的作用机制，以期为色氨酸及其代谢物防治AD的临床应用和药用价值开发提供参考。
1 网络药理学及分子对接分析工具
2 方法
2.1 目标化合物的筛选
在pathbank数据库输入“tryptophan”查看色氨酸的代谢通路和代谢物，结合色氨酸及其代谢物与AD和神经退行性疾病相关的文献筛选目标化合物。
2.2 目标化合物作用靶点的筛选
根据筛选的目标化合物，从 Swiss Target Prediction数据库获得各化合物对应的人源作用靶点，合并各目标化合物筛选对应的靶点，去除重复靶点。再通过蛋白质数据库Uniprot转化为对应的基因。
2.3 AD相关靶点的筛选
AD相关靶点从 GeneCards 、OMIM、TTD数据库获得，合并各数据库筛选的AD疾病靶点并去除重复靶点。
2.4 目标化合物-靶点网络图的构建
韦恩图是将AD疾病靶点和目标化合物作用靶点导入Venny 2.1在线平台映射筛选获得两者的交集靶点并绘制而得。在Excel 表格中建立目标化合物与预测交集靶点的对应关系，导入 Cytoscape3.9.1软件建立“目标化合物-靶点”网络图。
2.5 PPI网络图的构建及核心靶点蛋白的筛选
交集靶点蛋白上传至 String 数据库，设置相应参数进行分析并获得PPI网络。将所得数据导入 Cytoscape 3.9.1，构建交集靶点蛋白的 PPI 网络图。利用 Cytoscape 分析交集靶点蛋白 PPI 网络的拓扑参数中度中心性、紧密中心性和中介中心性筛选核心靶点蛋白，三者数值越大说明该节点在网络中越重要。
2.6 交集靶点基因的富集分析
利用DAVID 数据库对交集靶点基因进行富集分析，包括基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。GO 分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）的分析。将输出文件导入至 Excel 工作表中，筛选出 P<0.05 的功能和通路。运用微生信云平台对GO富集分析中BP、CC、MF排在前10的富集条目和KEGG 通路富集前20的富集条目进行可视化分析、作图。
2.7 目标化合物－靶点－通路－AD网络构建
将AD、目标化合物、交集靶点、富集通路数据上传到Cytoscape 3.9.1，构建“目标化合物－靶点－通路－疾病网络”图，分析目标化合物防治AD的作用机制。
2.8 分子对接验证
从pubchem数据库中下载化合物3D结构并保存为SDF格式，随后导入到Chemdraw 3D中，利用MM2模块进行能量最小化，获得能量最低的优势构想并保存为mol2文件。从PDB数据库中下载蛋白结构，随后利用pymol分别进行可视化，然后用Mgtools 1.5.6通过去水、加氢，计算电荷，合并非极性氢等处理后，将配体与受体分别保存为pdbqt。使用Autodock vina 1.1.2将配体与受体进行对接，生成对接参数，取打分较高的构想并用pymol和discovery studio进行可视化。
3 结果
3.1 目标化合物与阿尔茨海默病作用靶点筛选
通过查阅文献和Pathbank数据库共获得包括色氨酸及其代谢物共11个目标化合物，分别是色氨酸（Tryptophan，Trp）、色氨（tryptamine）、黄嘌呤酸（Xanthurenic Acid，XA）、5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic Acid，5-HIAA）、邻氨基苯甲酸（Anthranilic Acid，AA）、朱砂酸（Cinnabarinic Acid，CA）、犬尿酸（Kynurenic Acid，KA）、褪黑素（melatonin）、N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine，NFK）、喹啉酸（Quinolinic Acid，QA）、血清素（serotonin）。使用Swiss Target Prediction数据库预测目标化合物靶点，去重，筛选得到233个靶点。从Genecards、OMIM、TTD数据库获取阿尔茨海默病疾病靶点，汇总去重后，得到靶点1824个。将筛选的靶点上传至Venny在线平台取交集，得到交集靶点80个，并绘制韦恩图，见图1。
图1 目标化合物与阿尔茨海默病的共同靶标Fig.1 Venn diagram of Alzheimer’s disease targets and target compounds targets |
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3.2 “目标化合物-靶点”网络图构建
运用 Cytoscape软件构建目标化合物-靶点网络，见图 2。其中，最内圈为11个目标化合物，两外圈节点代表交集靶点，边线代表目标化合物与靶点间的相互作用。在图2网络中，褪黑素、血清素对应的靶点最多，共有 65个，提示褪黑素、血清素处于网络关键地位，可能成为色氨酸代谢物中发挥防治AD的关键成分。
图2 “目标化合物-靶点”网络Fig.2 “target compounds- target” network diagram |
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3.3 目标化合物与AD疾病共同靶点PPI网络
色氨酸及其代谢物防治AD的作用靶点的PPI网络图见图3。综合参考拓扑学参数预测核心靶点可能为基质金属蛋白酶9(MMP9)、核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、表皮生长因子受体（EGFR）等。筛选出的关键靶点与AD病理生理发生密切相关，色氨酸及其代谢物与关键靶点相互作用，发挥多靶点防治AD的作用机制。但仍需通过GO和KEGG富集分析、分子对接加以验证推测。
图3 目标化合物与阿尔茨海默病共同靶点PPI网络Fig.3 PPI network diagram of target compounds and Alzheimer's disease targets Not: Different colors in the figure represent the difference of topological parameters. The closer to the middle, the more critical the target is. |
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3.4 GO与KEGG富集分析
将色氨酸及其代谢物交集靶点上传至DAVID平台进行GO与KEGG富集分析，涉及GO分析475条，KEGG分析120条，运用微生信云平台对GO富集分析中BP、CC、MF排在前10的富集条目和KEGG通路富集前20的富集条目进行可视化分析，见图4和图5。色氨酸及其代谢物主要参与的 BP 包括对药物的反应化学性突触传递、信号转导、兴奋性突触后电位、细胞增殖的正调控、移动行为等。CC主要集中在质膜、突触、树突、谷氨酸能突触、膜筏等。MF主要涉及酶结合、神经递质受体活性、β-淀粉样蛋白结合、多巴胺结合、血清素结合等。色氨酸及其代谢物防治AD的主要代谢通路可能有多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、前列腺癌、cAMP信号通路、FOXO信号通路等通路。
图4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis |
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图5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis |
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3.5 目标化合物-靶点-通路-AD网络构建
将AD、目标化合物、交集靶点、富集通路数据上传Cytoscape 3.9.1 中，作图得到“目标化合物-靶点-通路-疾病”网络图，见图6。通过网络图可知，色氨酸及其代谢物关键目标化合物可能是褪黑素、血清素等，通过MMP9、EGFR、PTGS2等关键靶点，在多巴胺能突触、cAMP信号通路、 FOXO信号通路等关键通路中发挥防治AD的作用。
图6 目标化合物-靶点-通路-AD网络图Fig.6 Network diagram of target compound-target-pathway-AD |
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3.6 分子对接结果
综合PPI网络中degree、betweenness、closeness值筛选出关键靶点与色氨酸及其代谢物进行分子对接，受体分别为：MMP9（PDB ID：4xct）、NR3C1（PDB ID：4udd）、PTGS2（PDB ID：5ikr）、MAPK1（PDB ID：6slg）、EGFR（PDB ID：6wxn）。已知，结合能越低、氢键数越多说明受体蛋白和配体小分子的结合构象越稳定、结合活性越高。图7得到了受体蛋白与配体小分子两两之间最低结合能。图中标注数值为最低结合能，均<-5 kJ/mol。通过分子对接证实，所筛选关键靶点能够与色氨酸及其代谢物有效结合，从而发挥防治AD的作用。依据结合能，筛选MMP9受体蛋白与褪黑素、犬尿酸、色氨酸、5-羟基吲哚乙酸进行结合构象的相互作用可视化，可知代谢物与MMP9靶点多个位点结合，预测代谢物具有的防治AD的作用机制，是与相应靶点的多个位点结合后的最终呈现，见图8。
图7 分子对接结合能热图Fig.7 Thermal diagram of molecular docking binding energy |
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图8 分子对接结合构象相互作用示意图Fig.8 Schematic diagram of molecular docking bound conformational interaction |
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4 讨论
许多研究表明，AD与APP代谢、Aβ的沉积及Tau 蛋白的过度磷酸化等多因素息息相关
[9-10]。但目前，阿尔茨海默病还没有十分明确的预防和治愈手段，只能依据现代医学研究对其可能的发病因素采取相应的预防和治疗措施。近年有研究指出，先天免疫系统激活作为一种促进因子，在AD的发生发展过程中起着十分重要的作用
[11-12]。通过对正常人类大脑内1137个小分子进行全面筛选，明确色氨酸代谢是大脑先天免疫的调节器，也是潜在的内源性抗AD分子
[1]，提示色氨酸及其代谢物具有防治AD的作用。
本研究通过查阅文献和pathbank数据库，筛选确定了11个目标化合物。利用网络药理学，筛选出了目标化合物对应的疾病靶点80个，并构建了目标化合物与AD作用靶点的PPI网络图并进行了核心靶点蛋白的筛选，主要有MMP9、NR3C1、PTGS2、MAPK1、EGFR。这些核心靶点可能具有防治AD的重要作用。有文章指出，基质金属蛋白酶家族成员，包括MMP9，与AD密切相关。正常情况下，体内基质金属蛋白酶水平很低，但在AD脑内特定部位却过度表达。MMP9可以通过促进Aβ的降解和可溶性Aβ的产生、调节突触可塑性等发挥神经保护作用。同时也可以通过破坏血脑屏障和血液－脑脊液屏障、促进神经炎症、促进tau蛋白寡聚体的形成等损伤神经元
[13]。正因为MMP9表现出保护和损伤两种相反作用，而进一步探究色氨酸及其代谢物与MMP9的作用机制，可以明确其对AD具体的防治作用。另有文章报道，在AD患者中，心理症状和认知缺陷与下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 轴的早期失调有关，HPA轴失调与血浆和脑脊液中糖皮质激素（GC）水平升高有关
[14]。在AD的转基因小鼠模型中，GC增加了病理标志物的产生，例如：Aβ和tau蛋白，而使用糖皮质激素受体（NR3C1）拮抗剂可显著改善模型小鼠的痴呆行为表现
[15]。因此，NR3C1被认为在AD防治中具有核心作用。研究发现，在阿尔茨海默病患者的大脑区域发现PTGS2（COX-2）表达显著增强
[16]， Pu Wang等研究证实
[17]， COX-2 在AD发展和进展过程中被激活，并可能导致AD的发病机制。具体表现在COX-2促进小脑β淀粉样斑块中Aβ的扩散和沉积以及导致tau蛋白过度磷酸化。因此，COX-2有可能是AD的潜在治疗靶点。早期研究发现，在AD海马的神经原纤维缠结和老年斑神经突触中检测到MAPK1（ERK2）
[18]，说明在AD发展和进程中，ERK2被异常激活并表达。进一步探究ERK2在AD病理生理发生发展过程扮演的角色发现，Aβ可异常活化ERK2，导致细胞功能紊乱，并诱发神经元凋亡。此外ERK2过度活化，会导致tau蛋白过度磷酸化，造成神经毒性级联反应，最终引起神经细胞凋亡和坏死
[19]。更有研究证明，在AD患者大脑的星形细胞中，EGFR表达明显上调
[20]，而使用EGFR抑制剂可以改善AD病理和行为表现，其作用机制是通过诱导自噬和反应性星形胶质细胞的衰减来发挥治疗作用
[21]。综上，AD病理机制错综复杂，梳理出相应的关键靶点，对于探究如何预防和治疗AD具有重要意义。本研究通过网络药理学，以色氨酸及其代谢物为药效分子，筛选出与AD相关性作用靶点，为药物开发和临床应用提供了参考。但还需对相应靶点进行验证研究，以便探明其确切的作用机制。
本研究进一步通过GO富集分析，预测了靶点通过结合于树突、突触等部位相应蛋白，发挥调节信号传递、转导、细胞增殖等作用。KEGG富集分析，揭示了色氨酸及其代谢物可能作用于多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、前列腺癌、cAMP信号通路、FOXO信号通路等通路发挥防治AD的作用。根据网络药理学分析可知，多巴胺能突触信号通路与多巴胺D2受体（DRD2）关联，血清素、褪黑素等作用于DRD2靶点，从而形成化合物-靶点-信号通路-疾病网络，以便明晰色氨酸及其代谢在AD防治中的作用机制。多巴胺能突触信号通路作为AD中重要的信号转导通路之一，在神经递质协调、记忆巩固、神经元突触功能等过程中发挥着重要的生物学作用
[22]。有研究报道，DRD2在多巴胺能末端表达以调节多巴胺释放，并具有调节啮齿动物的皮质突触修剪的重要作用
[23]。AD的任何病理阶段，都可发生不同程度的多巴胺功能障碍，且损伤发生得越早，认知能力下降就越快
[24]。褪黑素对锰诱导的多巴胺能神经系统损伤可通过上调多巴胺转运体和多巴胺受体1，增加多巴胺含量来改善系统损伤
[25]。此外，犬尿酸作为色氨酸神经保护代谢分支产物，其体内浓度升高会间接改变多巴胺能信号传导
[26]。由此可知，色氨酸代谢物通过多巴胺能突触信号通路，表现出潜在的防治AD的作用。
cAMP信号通路介导了从发育、细胞兴奋性、突触可塑性、学习和记忆到神经退化等许多神经过程。cAMP信号通路中，关键分子为第二信使-环磷酸腺苷（cAMP），cAMP是由腺苷酸环化酶(AC)催化产生，可激活蛋白激酶A(PKA)，再激活或抑制下游蛋白，如cAMP应答元件结合蛋白(CREB)，从而行使多种生理功能；磷酸二酯酶(PDE)可负反馈调控cAMP的胞内水平
[27]。越来越多的证据表明，cAMP的上调可能与阿尔茨海默病神经变性有关
[28]，这一观点在AD患者脑脊液中的cAMP显著升高和AD动物模型cAMP信号通路被激活得到证实
[28-29]。此外，有报道表明，CREB可调节神经元生长、神经元分化/增殖、突触可塑性、神经发生、空间记忆、长期记忆形成等多种生理功能，并且CREB信号传导的损害可导致多种AD病理进程的发生
[30]。在体外，褪黑素可升高CREB表达水平，提示褪黑素可增强由CREB介导的认知和记忆功能
[31]。综上，可明确cAMP信号通路在AD中扮演的重要角色，同时也表明色氨酸代谢物可作用于cAMP信号通路相关蛋白，发挥防治AD的作用。
众所周知，AD被认为是一种与年龄密切相关的神经变性疾病。因此，延迟衰老过程可能会降低AD的风险或延缓其发病机制这种假设是合理的。FOXO是与长寿紧密相关的一种转录因子，哺乳动物中存在四个FOXO基因，即FOXO1、FOXO3、FOXO4 和 FOXO6。这四种转录因子参与调节哺乳动物生长、抗逆性、代谢、细胞分化和凋亡的多种细胞途径。FOXO的抗氧化作用是其最关键的功能。由于活性氧对细胞产生的恶化作用并诱导衰老，因此FOXO可用于通过改善细胞的抗氧化能力来影响衰老。此外，FOXO还可参与自噬，介导干细胞功能等来影响衰老
[32]。更有多项研究表明，人类长寿与FOXO3a密切关联
[33⇓-35]。FOXO参与的多种生理和细胞途径可能具有潜在的AD防治作用，具体表现在如FOXO3a依赖去乙酰化酶SIRT1来减少暴露于Aβ期间的氧化应激和细胞损伤和SIRT1介导的FOXO3a去乙酰化保护细胞免受缺血性损伤等
[36]。有研究证实，血清素对产期母羊肝脏细胞和组织的磷酸化FOXO1蛋白表达具有显著下调作用，提高FOXO1基因的蛋白表达，促进肝脏糖异生，改善能量负平衡
[37]。另有报道阐述褪黑素可以通过 SIRT1-FOXO 途径调节能量稳态、氧化应激和细胞自噬等多种生理作用
[38]。综上，通过色氨酸代谢物作用于FOXO信号通路防治AD具有可行性。
已有研究表明，AD与前列腺癌有关，治疗前列腺癌的雄激素剥夺疗法会增加AD的发病风险
[39-40]，说明前列腺癌也是AD发病因素之一。一项研究表明，色氨酸代谢酶2、3-双加氧酶2(TDO2)在前列腺癌患者肿瘤组织中表达升高，提高药物耐药性。阻断该代谢途径利于改善前列腺癌治疗效益
[41]。更有报道表明，色氨酸代谢物5-甲氧基色氨酸可对抗肿瘤生长和转移
[42]。因此，从色氨酸代谢途径和代谢物角度改善前列腺癌治疗效果，可降低AD发病风险。网络药理学分析显示，神经活性配体-受体相互作用与AD相关性高，且与血清素作用的NR3C1靶点关联。
赵明镜等阐述了氨基酸类神经递质与认知活动的关系
[43]，强调脑内氨基酸是中枢神经系统内重要的神经递质，其通过对神经元兴奋性和抑制性的控制在认知活动过程中发挥着举足轻重的作用。本研究也阐述了抑制性神经递质血清素可保护中枢神经系统。此外，AD脑内芳香族氨基酸代谢改变对AD病理进程有深远影响。色氨酸作为芳香族必需氨基酸，不同的代谢途径，可分别起到保护中枢神经系统和上调AD的负作用
[44]。然而，关于AD脑中氨基酸代谢和信号传导的认识还远远不够完整和深入。本研究首次选取与AD密切相关的色氨酸及其代谢物，通过网络药理学预测出防治AD的关键蛋白靶点及通路，通过分子对接验证了相应化合物与核心靶点蛋白之间的亲和力，表现出良好的结合结果。本研究预测出多个防治AD的关键靶点和多条信号通路，针对关键靶点和通路，可为药物筛选和临床诊疗提供参考。本研究后续还将开展一系列实验验证基于网络药理学预测出的关键靶点和通路，阐明色氨酸及其代谢物在防治AD中起到的具体作用机制。
