血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是指由多种脑血管病变导致脑组织损害引起以认知功能减退为主要特征的临床综合征，临床常表现为记忆力、解决日常问题的能力及反应能力等方面的障碍
[1-2]，在我国65岁以上人群中VaD的发病率约1.5%，占全部痴呆类型的20%~30%
[3]。VaD是脑梗死常见严重并发症，迄今为止，尚无针对VaD病理的干预药物应用于临床，这也为探索新的发病机制提供机遇和挑战。
研究发现，肠道菌群失调通过神经、内分泌及免疫等途径与大脑相互作用，这种关系也称为“微生物-肠-脑”轴
[4]，参与多种中枢神经系统疾病的发生。肠道菌群与其产物直接参与血小板活性的激活及动脉粥样硬化斑块的形成
[5]，提示缺血性卒中危险因素的发生发展可能与肠道菌群有关。肠道菌群与VaD相关研究鲜有报道，对于VaD患者的肠道菌群丰度尚不明确，物种丰富度尚未明确。因此，我们对大动脉粥样硬化性脑梗死所致VaD患者肠道菌群的丰度进行初步研究，并探讨二者间的相关性，从而为VaD的发病机制提供新的思路。
1 资料和方法
1.1 研究对象
收集2019-01~2019-11在新疆医科大学附属中医医院脑病科大动脉粥样硬化性脑梗死所致的血管性痴呆患者30例作为VaD组，其中男性18例，女性12例，平均年龄(68.17±10.249)岁。同时收集同期在本院进行健康体检的年龄、性别相匹配的认知功能正常者30名作为对照组，其中男性13例，女性17例，平均年龄(72.57±6.372)岁。所有研究对象均能提供合格的粪便样本，配合完成问卷调查。
病例组纳入标准
[6⇓-8]：①采用美国《精神疾病诊断与统计手册》第4版修订版标准、世界卫生组织《国际疾病分类诊断标准》第10版标准、美国国立神经病与脑卒中研究所/瑞士神经科学研究国际协会标准、中国国家卫生计生委脑卒中防治工程委员会制定的中国血管性认知障碍诊疗指导规范（2017年）中临床诊断标准，符合血管性痴呆诊断。②Hachinsk缺血量表评分≥7分。③新疆医科大学附属中医医院神经心理学量表检查筛查诊断符合认知功能障碍;其中简易精神状态评价量表（MMSE）评分（文盲≤17分为痴呆，小学≤20分为痴呆，中学≤22分为痴呆，大学≤23分）。④由改良TOAST分型大动脉粥样硬化性血栓形成所致脑梗死。
对照组纳入标准：（1）无明显记忆力减退主诉，无神经系统局灶症状;（2）CDR评分为0分，总体认知功能评定正常，MMSE评分高于相应文化水平，老年抑郁问卷评分处于正常范围。
病例组及对照组排除标准：①经美国《精神疾病诊断与统计手册》第4版修订版标准诊断为其他原因的痴呆、抑郁症或其他精神障碍者;②因严重颅脑外伤、癫痫、帕金森病等所致的认知功能障碍者;③患有其他系统的严重疾病;④3个月内有服用抗生素的病史;⑤有严重烟、酒等物质滥用情况;⑥慢性肠道疾病;⑦呼吸系统疾病。
所有受试者均签署知情同意书，通过新疆医科大学附属中医医院伦理委员会批准（批件号：2016XE0137）。
1.2 研究方法
1.2.1 粪便样本采集及预处理
使用专用的OMNIgene•GUT(OMR-200)粪便样品采集管采集所有受试者的新鲜粪便，迅速放入冰盒后转运至实验室进行分装处理。分装处理如下：称取粪便样本100 mg放入2 ml无菌离心管中3份，其中2份进行基因组DNA提取测序，1份备用。所有标本在采集后15 min内处理完毕，保存于-80 ℃冰箱中。
1.2.2 粪便DNA的抽提
提取每份粪便标本的微生物基因组DNA。提取获得的DNA通过酶标仪、NanoDropTM分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测其体积、总量、浓度、纯度以及完整性，以确定是否符合试验要求。
1.2.3 构建文库
检测合格的样品将进行PCR扩增以构建文库：以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，构建合格的文库。用合格的文库进行cluster制备和测序，最终得到的高通量测序数据用于下游的生物信息分析。
1.2.4 生物信息分析
首先经过数据过滤，测序得到的16S序列进行操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs)分类。然后通过OTUs与数据库比对，对OTUs进行物种注释，获得门（phylum），纲（class），目（order），科（family），属（genus），种（species）各分类学水平的数据;最后，基于OTUs和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析，确定肠道菌群的具体类型、丰度、系统发育和整体结构等。
1.3 统计分析
使用SPSS（版本23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）用于统计分析。符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（x±s），定性资料采用频数（%）表示，偏态分布定量资料采用中位数表示。正态分布定量资料两组之间比较采用两独立样本t检验，偏态分布定量资料两组之间比较采用秩和检验，定性资料组间率比较采用卡方检验。在获知组间物种差异的基础上，利用Lefse分析工具用线性判别分析（LDA）对数据进行降维和评估差异显著的物种的影响力（即LDAscore），并绘制LDA值进化分支图。设定P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床基线资料
如表1所示，VaD患者和对照组间的性别、年龄、教育程度差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。
表1 VaD组与对照组一般临床资料比较Tab 1 Comparison of general clinical data between VaD and control groups |
| 分组 | 年龄(岁，x±s false) | 性别(n，%) | 教育程度(年，x±s false) |
|---|
| VaD组（n=30） | 68.17±10.249 | 18(60.0) | 9.1±5.054 |
| 对照组（n=30） | 72.57±6.372 | 13(43.3) | 8.73±4.984 |
| t/c2值 | -1.997 a | 1.669 b | 0.283 a |
| P值 | 0.051 | 0.196 | 0.778 |
| Note：*a is the t-value，*b is c2 values |
2.2 OTU 数目
OTU序列共注释到31个菌属，VaD组OTU数目(809.53±143.74)与对照组比较(885.3±262.36)，两组差异无统计学意义(t=1.387，P>0.05)。
2.3 生物多样性分析
2.3.1 Alpha多样性分析
Alpha多样性指数包括chao1指数、shannon指数、simpson指数、goods_coverage指数、observed_species指数、PD_whole_tree指数，绘制六个指数的稀释性曲线。选用chao1指数(t=0.94736，P>0.05)、shannon指数(t=0.219，P=0.230)、simpson指数(t=0.112，P>0.05)、goods_coverage指数(t=0.92931，P>0.05)、observed_species指数(tt=0.39116，P>0.05)、PD_whole_tree指数(t=0.74123，P>0.05)，同时分别绘制六个多样性指数曲线，研究显示VaD组与对照组间6个多样性指数差异均无统计学意义(均P>0.05)。根据实验结果绘制的六个指数的稀释性曲线发现，随着抽取序列数的增加，曲线趋于平缓，说明样本的测序数据量合理，表明痰阻血瘀型VaD组和对照组的样本测序量满足细菌多样性分析。见图1。
图1 多样性指数稀释曲线Fig 1 dilution curve of diversity index Note: The observed_species index dilution curve and the shannon index dilution curve will flatten out with the increase of the number of extracted sequences, indicating that the amount of sequencing data is reasonable |
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对照组的shannon指数、simpson指数、goods_coverage指数、observed_species指数多样性指数中位数大于VaD组，提示对照组细菌的丰富度高于VaD组，表明对照患者的肠道菌群群落组成较VaD组更复杂。见图2。
图2 OTU多样性指数组间比较boxplot图Fig 2 boxplot of OTU diversity index comparison between groups Note: figure a is boxplot chao1 index, b is shannon index boxplot, c is simpson index boxplot, d is good_coverage index boxplot, e is observed_species index boxplot, f is PD_hole_tree index boxplot. |
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2.3.2 beta多样性分析
60个样本PCoA(2D)分析(unweighted)结果显示，提供基于多种距离矩阵的分析结果，通过 PCoA 可以观察个体或群体间的差异，图中每个点代表一个样本，相同颜色为相同分组，蓝色的点代表VaD组，红色的点代表对照组，VaD组和对照组在第一主成分(10.75%)可显著分离，差异具有统计学意义，见图3。
图3 PCoA(2D) VaD组和对照组在第一主成分(10.75%)可显著分离Fig 3 PCoA(2D) VAD and control group could be separated significantly in the first principal component (10.75%) |
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2.3.3 群落结构分布
采用RDP classifier Naive Bayesian分类算法对代表序列与数据库进行比对注释，本次测序OTU序列在属水平上共注释到31个菌属。其中VaD组中拟杆菌（Bacteroides）、乳杆菌（Lactobacillus）、大肠埃希氏菌（Escherichia-Shigella）的丰度较对照组明显偏高;对照组中双歧杆菌（Bifidobacterium）、链球菌（Streptococcus）的丰度较VaD组明显偏高。两组菌种丰度比较有明显差异性。见图4。
图4 各样本群落结构TOP30柱状图Fig 4 TOP30Heatmap of each sample community structure |
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通过TOP30Heatmap显示，VaD组中拟杆菌（Bacteroides）、乳杆菌（Lactobacillus）、大肠埃希氏菌（Escherichia-Shigella）丰度较高;对照组中双歧杆菌（Bifidobacterium）、罗氏菌（Roseburia）、劳特氏菌（Blautia）丰度较高。
肠道巴恩斯氏菌（Barnesiella）、柯林斯氏菌（Collinsella）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、小杆菌（Dialister）在VaD组和对照组中的丰度均偏低;两组间相比，VaD组中肠道巴恩斯氏菌（Barnesiella）、柯林斯氏菌（Collinsella）、小杆菌（Dialister）、克雷伯氏菌（Klebsiella）的丰度较对照组高。详见图5。
图5 各样本物种丰度TOP30HeatmapFig 5 species richness of each sample:TOP30Heatmap |
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2.3.4 微生物多元变量统计分析
2.3.4.1 差异物种 Boxplot 图
在属水平，VaD组中志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）（P=0.001）、克雷伯氏菌（Klebsiella）（P=0.014）、普氏菌（Prevotella_9）（P=0.02）菌种丰度较对照组稍高。对照组中Blautia（劳特氏菌属）（P=0.032）、毛螺菌（Lachnospiraceae_NK4A136_group）（P=0.002）、纺锤链杆菌（Fusicatenibacter）（P=0.034）、瘤胃菌（Ruminococcaceae_UCG-014）（P=0.001）、不可培养细菌（uncultured_bacterium）（P=0.000）、测序后无法区分的菌属（Other）（P=0.018）的菌种丰度较VaD组明显偏高。详见图6。
图6 差异物种丰度 Top10 boxplot 图Fig 6 Top10 boxplot plot of differential species abundance Note: Vascular dementia group: VD; Group C: healthy control group |
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2.3.4.2 肠道菌差异分析
通过Lefse分析、Cladgram得出结果，在VaD组中琥珀酸弧菌科（Succinivibrionaceae）、肠杆菌科 （Enterobacteriaceae）、志贺氏杆菌属 (Escherichia_Shigella)、变形菌门（Proteobacteria）丰度较高，为优势菌属;在对照组中，韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）、劳特氏菌属（Blautia）、普雷沃菌属（Prevotella）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）等丰度较高，为优势菌属。详见图7、图8。
图7 Lefse分析VaD组与对照组菌群差异Fig7 Lefse analysis of the microflora differences between the VaD and control groups Note: Vascular dementia group: VD; Group C: healthy control group; LDA: Linear discriminant analysis; green and red bar graphs represent the VD group and the C group, respectively, and length represents the LDA score value, indicating the effect size of significantly different species; LDA score (log10)> 2, P<0.05 |
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图8 Cladgram显示VAD组与对照组的差异菌群Fig 8 Cladgram shows the differential flora between the VAD group and the control group Note: The circles radiating from inside to outside in the figure represent the taxonomic level from phylum to genus; each small circle at different taxonomic levels represents a classification at that level; the diameter of the small circle is proportional to the relative abundance; the species without significant differences are uniformly colored yellow, and the different species are colored by the group |
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3 讨论
人类肠道中存在大量的微生物群，肠道菌群能够通过“微生物-肠-脑”轴调节宿主大脑功能和行为。肠道微生物群组成的改变被证明与许多神经精神疾病有关，包括抑郁症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)等
[9]。动脉粥样硬化性血栓形成性卒中患者的肠道菌群结构发生显著紊乱，并且其紊乱程度和卒中严重程度有关
[10]。其菌群紊乱的表现为机会致病菌显著增加，如肠杆菌、巨型球菌、脱硫弧菌等;常驻菌或有益菌显著减少，如拟杆菌、普氏菌等。Yamashiro等通过多元回归分析发现缺血性卒中患者肠道菌群紊乱程度与宿主的代谢水平及炎症水平有关
[11⇓-13]。在脑卒中的不同阶段，其肠道菌群分布不同，在脑卒中急性期和恢复期中肠道菌群多样性明显较健康者减少，其特征性菌群亦有所不同
[12]。
本研究共60个样本，利用16SrRNA高通量测序技术首次对新疆乌鲁木齐市地区大动脉粥样硬化性缺血性脑卒中所致血管性痴呆患者及认知功能正常健康人群进行肠道菌群的构成及多样性进行分析，质控之后的clean tags数据量分布在38065~41940之间，valid tags平均长度分布在398.03~424.8 bp，各样本OTU个数分布在488~1660之间，shannon指数曲线提示各样品曲线趋于平坦，说明样本量充分，测序数量合理。
本项目OTU序列共注释到31个菌属，未发现血管性痴呆患者肠道菌群的菌属种类与认知功能正常健康人群有差异性，但对照组的shannon指数、simpson指数、goods_coverage指数、observed_species指数多样性指数中位数大于VaD组，提示血管性痴呆患者肠道菌群丰度相对降低，健康人群的肠道菌群群落组成更复杂，可能含有更丰富的肠道菌群新物种。
在β多样性分析中，PCoA图显示有10.75%的主成分差异，可完全区分VaD患者与认知功能正常人群的粪便标本，两类人群肠道菌群虽有差异，但差异并未集中于某一特定物种。对样本进行Weighted UniFrac分析，除样本丰度差异，显示血管性痴呆组混杂在对照组样本中无法明显区分，提示血管性痴呆患者肠道菌群的进化谱系与健康人无显著差异。
本研究显示，VaD患者中变形菌门丰度较高。在健康成人的肠道中蛋白菌只占其中的小部分，不足1%
[14]。蛋白菌过度增长会使肠道内部原有的菌群抵抗外来病原菌定殖的能力下降，导致病原体入侵，进一步促进炎症反应，变形菌门的丰度增加被认为是肠道菌群紊乱的标志
[15]。因此我们认为血管性痴呆患者可能存在肠道菌群失调。有研究发现菌群失衡会影响（NMDA）受体的大脑神经化学的变化并伴随行为异常
[16-17]，NMDA受体受损是导致痴呆的重要机制之一。
本研究显示VaD组乳杆菌、志贺氏杆菌属、琥珀酸弧菌科、肠杆菌科中的克雷伯氏菌丰度较高。乳杆菌属被认为是传统的有益菌，在特定细菌的作用下能将乳酸转化成具有抗炎作用的SCFAs
[16-17]，对其干预可以改善AD患者的认知
[18]。本研究显示乳杆菌属在VaD患者丰度较高，目前尚未见VaD患者与乳杆菌属相关研究及报告，待今后进一步研究探讨二者相关性。本研究还显示肠道巴恩斯氏菌、小杆菌、柯林斯氏菌在VaD组中的丰度也高于认知正常组。 Zitvogel教授及团队研究发现肠道巴恩斯氏菌可以激活免疫应答反应
[19]，影响中枢神经系统，导致认知功能的改变。Karlsson等发现动脉粥样硬化患者的肠道微生物中柯林斯氏菌丰富
[20]，且发现动脉粥样硬化患者肠道中的细菌更易合成肽聚糖，激活中性粒细胞以及促进促炎因子的释放，影响中枢神经致认知功能发生变化。小杆菌与肥胖具有相关性，而肥胖是VaD的危险因素之一，推测小杆菌与VaD的发生可能具有相关性。
综上所述，本研究发现VaD患者的肠道菌群多样性显著降低，其肠道菌群变化并非单一致病菌的增加，推测血管性痴呆可能存在肠道菌群失调，而肠道菌群及其代谢产物可能是通过神经递质、免疫代谢以及神经内分泌途径参与VaD的病理进程及发生发展，并对大脑的功能产生影响进而导致VaD患者的认知和行为异常。本研究的不足之处是采用16SrRNA测序技术，分辨率较低，仅局限于种属水平，因此今后可以利用宏基因测序，开展更大样本、不同血管性痴呆亚型的临床研究及动物实验，深入探索VaD机制，为VaD患者提供多元化的全新治疗选择。
